Kontekst badania
W ostatnich latach coraz większą uwagę poświęca się obecności farmaceutyków w środowisku wodnym, a jednym z ich głównych źródeł są ścieki szpitalne (hospital wastewater, HWW). W odróżnieniu od ścieków komunalnych, HWW charakteryzują się znacznie wyższym stężeniem substancji aktywnych, zwłaszcza leków przeciwdrobnoustrojowych, co potwierdzają wcześniejsze badania wykazujące od 2- do nawet 150-krotnie wyższe poziomy farmaceutyków w HWW. Sytuacja ta jest szczególnie niepokojąca w krajach o niskim i średnim dochodzie, gdzie infrastruktura sanitarna jest często niewystarczająca, a ścieki szpitalne są odprowadzane bezpośrednio do kanalizacji miejskiej bez uprzedniego oczyszczania. W takich warunkach dochodzi do stałego wprowadzania do środowiska leków, bakterii opornych na antybiotyki (ARB) oraz genów oporności (ARG), co sprzyja rozwojowi i rozprzestrzenianiu się oporności antybiotykowej, stanowiącej jedno z najpoważniejszych wyzwań współczesnej medycyny i zdrowia publicznego. Mimo rosnącego zainteresowania problemem, nadal brakuje szczegółowych danych dotyczących składu chemicznego i mikrobiologicznego HWW w krajach rozwijających się, co ogranicza możliwość formułowania skutecznych strategii zarządzania i ograniczania zagrożeń środowiskowych.
Cele i hipotezy
Celem prowadzonych badań była kompleksowa ocena występowania farmaceutyków i opornych mikroorganizmów w ściekach szpitalnych pochodzących z dwóch dużych szpitali zlokalizowanych w Belo Horizonte (Brazylia). Zakres badanń obejmował ocenę profilu konsumpcji leków, identyfikację farmaceutyków i ich metabolitów metodą jakościowej analizy suspect screening (LC-QTOF MS), przeprowadzenie oceny ryzyka środowiskowego (ERA) z wykorzystaniem narzędzi in silico, a także oznaczenie obecności i poziomu antybiotykooporności bakteryjnej (ARB) oraz genów oporności (ARG).
Hipotezą badawczą było założenie, że znaczne ilości leków stosowanych w leczeniu szpitalnym, zwłaszcza antybiotyków, trafiają do ścieków w formie aktywnej lub jako metabolity, a jednocześnie promują one rozwój mikroorganizmów opornych na leczenie. Zakładano także, że w warunkach niewystarczającej infrastruktury sanitarnej stanowią one istotne zagrożenie dla środowiska wodnego i zdrowia publicznego.
Metody badawcze
Badanie przeprowadzono w dwóch szpitalach o charakterze trzeciego poziomu referencyjnego, posiadających odpowiednio 650 i 504 łóżka. Dane dotyczące konsumpcji farmaceutyków pochodziły z wewnętrznych rejestrów aptecznych i obejmowały okres jednego roku dla szpitala A oraz trzech lat dla szpitala B. Pobrano osiem próbek ścieków (cztery z każdego szpitala) w okresie od listopada 2021 r. do sierpnia 2022 r., zgodnie ze schematem próbkowania 24-godzinnego kompozytu. Analiza jakościowa obecności farmaceutyków została przeprowadzona za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas typu time-of-flight (LC-QTOF MS) w trybie suspect screening, obejmującym bazę 1922 potencjalnych związków. Przed analizą próbki zostały poddane ekstrakcji w fazie stałej (SPE). Ocena ryzyka środowiskowego (ERA) opierała się na obliczeniu ilorazu ryzyka (Risk Quotient, RQ) jako stosunku prognozowanego stężenia środowiskowego (PEC) do prognozowanego stężenia bez efektu toksycznego (PNEC). Wartości PEC obliczono w oparciu o dane dotyczące zużycia leków oraz ich współczynniki wydalania. Modele QSAR służyły do oszacowania toksyczności związków względem trzech poziomów troficznych: glonów, skorupiaków (Daphnia magna) oraz ryb. Dodatkowo, wykonano analizy mikrobiologiczne w celu oznaczenia obecności bakterii opornych na antybiotyki metodą agarową oraz oznaczenia poziomu wybranych genów oporności metodą qPCR.
Rezultaty badań i ich interpretacja
Zidentyfikowanie 113 substancji farmaceutycznych w próbkach ścieków szpitalnych, w tym 19 potwierdzonych analitycznie przy użyciu wzorców referencyjnych, ujawnia złożony charakter zanieczyszczeń obecnych w tej frakcji ściekowej. Metoda suspect screening umożliwiła jednoczesne przeszukanie dużej liczby związków chemicznych, z których znaczna część została zakwalifikowana jako związki podejrzane na podstawie zgodności masy cząsteczkowej, fragmentów jonów oraz profilu izotopowego. Dominującą grupą zidentyfikowanych leków były antybiotyki, co odzwierciedla intensywne stosowanie tych substancji w warunkach szpitalnych. W obu placówkach farmaceutyki tej klasy były najczęściej wykrywane i obejmowały takie związki jak cefazolina, ampicylina, meropenem, lewofloksacyna czy trimetoprim. Znaleziono także inne grupy terapeutyczne, takie jak środki przeciwbólowe (paracetamol, tramadol), przeciwzapalne (ibuprofen, naproksen), antydepresanty (escitalopram), diuretyki i leki przeciwnadciśnieniowe.
Spośród wykrytych farmaceutyków, aż 19 występowało we wszystkich ośmiu próbkach ścieków, co sugeruje ich stałą obecność w strumieniu HWW i potencjalną akumulację w środowisku wodnym w przypadku niewystarczającego oczyszczania. Co istotne, niektóre z wykrytych substancji – takie jak iopromid (środek kontrastowy) czy ifosfamid (lek onkologiczny) – są stosowane wyłącznie w warunkach szpitalnych, co czyni HWW unikalnym źródłem tych związków w środowisku.
Ocena ryzyka środowiskowego (ERA) wskazała, że 29 zidentyfikowanych farmaceutyków może stanowić potencjalne zagrożenie dla organizmów wodnych należących do trzech poziomów troficznych (glony, Daphnia magna, ryby). W szczególności, cztery związki osiągnęły wartości RQ przekraczające próg bardzo wysokiego ryzyka (RQ ≥ 2): ampicylina, escitalopram, iopromid i topiramat. Ampicylina, jako jedyny przedstawiciel klasy antybiotyków w tej grupie, wykazuje silny potencjał selekcyjny dla opornych mikroorganizmów, natomiast escitalopram i topiramat reprezentują substancje o działaniu na układ nerwowy, których wpływ na organizmy wodne nie jest w pełni poznany. Iopromid, środek kontrastowy, znany jest ze słabej biodegradowalności i niskiej podatności na konwencjonalne procesy oczyszczania.
Chociaż wiele substancji indywidualnie prezentowało niski poziom ryzyka (RQ < 1), analiza sumaryczna (RQmix) ujawniła istotne zagrożenia środowiskowe wynikające z obecności mieszanin farmaceutyków. Aż sześć z ośmiu analizowanych próbek wykazało bardzo wysokie ryzyko dla co najmniej jednego poziomu troficznego, a próbki z jednego ze szpitali osiągnęły wartości RQmix powyżej 890 dla Daphnia magna. Tego typu wartości wskazują na realne zagrożenie toksycznością chroniczną, potencjalnie wpływającą na struktury populacyjne i dynamikę ekosystemów wodnych. Obecność metabolitów (np. theobrominy, losartan carboxylic acid), które również zostały wykryte, dodatkowo komplikuje ocenę toksyczności ze względu na ograniczoną dostępność danych ekotoksykologicznych dla tych produktów przemian metabolicznych.
Mikrobiologiczna charakterystyka ścieków wykazała bardzo wysokie poziomy bakterii fekalnych (do 10¹⁰ MPN/100 mL) oraz obecność bakterii opornych na liczne antybiotyki pierwszego i drugiego rzutu, takie jak cefazolina, ceftriakson i azytromycyna. Warto podkreślić, że obecność bakterii opornych na azithromycinę była szczególnie wysoka w miesiącach pokrywających się z intensywnym stosowaniem tego leku w leczeniu zakażeń SARS-CoV-2, co sugeruje bezpośredni wpływ praktyk klinicznych na skład mikrobiologiczny ścieków. Niewielkie, ale istotne poziomy bakterii opornych na meropenem również budzą niepokój, jako że ten antybiotyk stosowany jest w leczeniu zakażeń wywoływanych przez patogeny wielolekooporne.
W zakresie analizy genotypowej, wykryto obecność niemal wszystkich analizowanych genów oporności, w tym blaKPC, sul1, ermB, qnrS, floR, catA1, mecA i blaOXA. Szczególnie wysoka liczba kopii blaKPC i sul1 w próbkach z jednego ze szpitali wskazuje na intensywną presję selekcyjną antybiotyków β-laktamowych oraz sulfonamidów. Obecność genu floR sugeruje występowanie szczepów bakterii o cechach wielolekooporności (MDR), co ma poważne konsekwencje dla dalszego rozprzestrzeniania się oporności w środowisku. Geny ARG były również bardziej liczne w ściekach szpitala, w którym zanotowano wyższe zużycie antybiotyków oraz większy zakres świadczonych usług klinicznych.
Ograniczenia zakresu badawczego
Pomimo szerokiego zakresu badania i zastosowania zaawansowanych metod analitycznych, niniejsze studium podlegało istotnym ograniczeniom metodologicznym i strukturalnym. Najbardziej znaczącym ograniczeniem była jakość uzyskiwanych danych ilościowych. Metoda suspect screening, mimo że skuteczna w identyfikacji obecności wielu związków chemicznych, nie pozwala na dokładne określenie ich stężeń. W rezultacie oszacowania ryzyka środowiskowego oparte były na danych szacunkowych (PEC) pochodzących z informacji o zużyciu leków i procentowej ekskrecji, co może prowadzić do niedoszacowania lub przeszacowania faktycznego ryzyka.
Dodatkowo, w analizie zastosowano modele QSAR do estymacji PNEC, co – mimo swojej wartości predykcyjnej – wprowadza potencjalne błędy wynikające z ograniczonej dokładności modeli matematycznych, uproszczeń biologicznych oraz braku walidacji empirycznej dla wielu związków. Modele te nie uwzględniają również interakcji między związkami, które w rzeczywistości mogą prowadzić do synergistycznych efektów toksycznych lub przeciwnie – ich neutralizacji.
Innym ograniczeniem była przestrzenna i temporalna reprezentatywność próbek. Analiza objęła jedynie dwa szpitale w jednym mieście, co nie pozwala na uogólnienie wyników na inne placówki służby zdrowia, ani tym bardziej na inne regiony Brazylii czy kraje o podobnym profilu sanitarnym. Ponadto, liczba próbek (osiem w ciągu 10 miesięcy) nie była wystarczająca do analizy sezonowości czy wpływu nagłych zmian w konsumpcji leków (np. w okresach zwiększonej hospitalizacji). Brak danych o skuteczności lokalnych oczyszczalni ścieków oraz brak próbek środowiskowych z odbiorników wodnych ogranicza również możliwość oceny rzeczywistego wpływu HWW na ekosystemy.
Nie bez znaczenia jest również fakt, że nie uwzględniono potencjalnych metabolitów wtórnych i produktów transformacji powstających w środowisku wodnym, które mogą być równie lub bardziej toksyczne niż związki wyjściowe. Ograniczenia te powinny być uwzględnione przy interpretacji wyników i planowaniu przyszłych badań.
Wnioski
Ścieki szpitalne są istotnym źródłem farmaceutyków i zanieczyszczeń biologicznych, w tym antybiotyków, metabolitów leków oraz bakterii i genów oporności, które mogą stanowić zagrożenie dla środowiska wodnego. Najczęściej wykrywaną klasą związków były antybiotyki, co pozostaje w zgodzie z ich dominującym udziałem w konsumpcji leków szpitalnych; w ściekach zidentyfikowano zarówno leki powszechnie stosowane, jak i związki charakterystyczne wyłącznie dla opieki szpitalnej (np. kontrasty radiologiczne, chemioterapeutyki). Ocena ryzyka środowiskowego wykazała, że 29 związków stanowi zagrożenie toksyczne dla organizmów wodnych, a cztery z nich (ampicylina, escitalopram, topiramat, iopromid) charakteryzują się bardzo wysokim ryzykiem (RQ ≥ 2), co wymaga ich dalszego monitoringu i kontroli. Analiza mieszanin substancji wykazała kumulatywne ryzyko ekologiczne (RQmix) w większości próbek HWW, przekraczające progi bezpieczeństwa dla organizmów wodnych, co sugeruje potrzebę uwzględnienia efektów mieszanin w przyszłych analizach ryzyka. Wysokie stężenia bakterii fekalnych oraz opornych na kluczowe antybiotyki (CFZ, CFT, AZT) potwierdzają, że HWW są potencjalnym źródłem selekcji i emisji patogenów lekoopornych do środowiska. Wszystkie analizowane próbki zawierały geny oporności (ARG), w tym blaKPC, sul1, ermB, qnrS i floR, co wskazuje na rozpowszechnienie wielolekoopornych mikroorganizmów w ściekach szpitalnych. Bezpośredni zrzut nieoczyszczonych ścieków szpitalnych do kanalizacji miejskiej, powszechny w krajach rozwijających się, znacząco zwiększa ryzyko środowiskowe i zdrowotne, zwłaszcza w kontekście oporności antybiotykowej. Uzyskane wyniki mogą posłużyć jako podstawa do opracowania strategii zarządzania HWW, w tym wdrażania technologii przedoczyszczania, klasyfikacji substancji priorytetowych i rozwoju ram prawnych w krajach o ograniczonej infrastrukturze sanitarnej.
Przeprowadzone badania dostarczają pierwszych w literaturze danych na temat jednoczesnego występowania szerokiego spektrum farmaceutyków, bakterii opornych na antybiotyki i genów oporności w ściekach szpitalnych z Brazylii, kraju o ograniczonym stopniu oczyszczania ścieków. Zastosowanie jakościowej analizy suspect screening (LC-QTOF MS) w połączeniu z oceną ryzyka środowiskowego (ERA) i analizą oporności mikrobiologicznej umożliwiło kompleksową ocenę zagrożeń wynikających z emisji HWW. Nowością naukową jest integracja danych dotyczących konsumpcji leków, identyfikacji związków chemicznych i analizy oporności w jednym badaniu terenowym, co dostarcza silnych dowodów na potrzebę włączenia HWW do polityk środowiskowych i zdrowotnych.
Artykuł opublikowano w Environmental Research.