Kontekst badania
Współczesna presja cywilizacyjna, związana z intensyfikacją stosowania antybiotyków zarówno w medycynie, jak i w produkcji rolnej, prowadzi do narastającego globalnego problemu antybiotykooporności. Oczyszczalnie ścieków komunalnych (WWTP – wastewater treatment plants) stanowią istotny punkt kontrolny w cyklu obiegu mikroorganizmów i zanieczyszczeń antropogenicznych, w tym bakterii opornych na antybiotyki (ARB) oraz genów oporności (ARGs). Choć procesy oczyszczania biologicznego i chemicznego w WWTP są w stanie redukować ogólne obciążenie mikrobiologiczne, coraz więcej dowodów wskazuje, że ścieki oczyszczone nadal zawierają zarówno aktywne mikroorganizmy, jak i pozostałości materiału genetycznego. W tym kontekście szczególnego znaczenia nabierają badania metagenomiczne, które pozwalają na kompleksową analizę składu taksonomicznego i funkcjonalnego mikrobiomu w ww. środowiskach.
Cele i hipotezy
Głównym celem niniejszego badania było określenie struktury mikrobiologicznej oraz repertuaru genów oporności na antybiotyki obecnych w ściekach oczyszczonych, opuszczających miejską oczyszczalnię ścieków. Badanie miało na celu wykorzystanie technologii sekwencjonowania metagenomicznego nowej generacji (NGS) do identyfikacji nie tylko dominujących taksonów bakteryjnych, ale także szerokiego spektrum ARGs, z uwzględnieniem ich potencjalnego wpływu na środowisko odbiorcze. Autorzy postawili hipotezę, że nawet po zakończeniu standardowych procesów oczyszczania, ścieki zawierają liczne i różnorodne geny oporności oraz mikroorganizmy potencjalnie patogenne, które mogą stanowić źródło dyfuzji oporności w ekosystemie wodnym.
Metody badawcze
W niniejszym badaniu zastosowano zintegrowaną metodykę metagenomiczną w celu szczegółowej analizy mikrobiologicznego i genetycznego profilu ścieków oczyszczonych, opuszczających komunalną oczyszczalnię ścieków zlokalizowaną w Słowenii. Oczyszczalnia ta obsługuje dużą aglomerację miejską, obejmującą gospodarstwa domowe, szpital, przemysł spożywczy oraz zakłady produkcyjne, co czyni ją reprezentatywnym modelem dla tego typu instalacji w Europie Środkowej. Pobór próbek przeprowadzono w punkcie odpływu końcowego, po zakończeniu wszystkich etapów technologicznych, w tym biologicznego oczyszczania osadem czynnym oraz końcowej dezynfekcji promieniowaniem UV. Wybór lokalizacji poboru próbek był celowy, gdyż umożliwiał ocenę stopnia oczyszczenia oraz potencjalnego zagrożenia mikrobiologicznego i genetycznego związanego z finalnym odprowadzeniem ścieków do środowiska wodnego.
Z pobranych próbek wody poddanych filtracji membranowej (0,22 µm) wyizolowano całkowity DNA środowiskowy przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA z próbek wodnych, z zachowaniem standardów aseptycznych i kontroli jakości. Otrzymany materiał genetyczny został następnie poddany kwantyfikacji metodą fluorometryczną oraz ocenie integralności za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Po zatwierdzeniu jakości i ilości DNA, próbki przygotowano do sekwencjonowania metodą typu shotgun, co pozwalało na uzyskanie nieuprzednio zselekcjonowanego, reprezentatywnego profilu całego genomowego materiału mikrobiologicznego obecnego w środowisku próby.
Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie Illumina HiSeq w trybie paired-end (2×150 bp), co zapewniło wysoką dokładność odczytu oraz dużą głębokość sekwencjonowania, niezbędną dla detekcji również rzadko występujących organizmów i genów. Surowe dane sekwencyjne zostały następnie poddane obróbce bioinformatycznej: usunięto niskiej jakości odczyty, adaptery sekwencyjne i powtórzenia techniczne, a pozostałe odczyty znormalizowano. Analizę taksonomiczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Kraken2 z bazą odniesienia NCBI RefSeq, co umożliwiło precyzyjne przypisanie odczytów do poziomu taksonomicznego od typu po rodzaj.
W celu identyfikacji genów oporności na antybiotyki (ARGs) zastosowano przeszukiwanie bazy danych CARD (Comprehensive Antibiotic Resistance Database) z wykorzystaniem narzędzia RGI (Resistance Gene Identifier), które umożliwia detekcję zarówno znanych, jak i potencjalnie nowych wariantów genów oporności, na podstawie struktury sekwencji oraz mechanizmu działania. Dane metagenomiczne analizowano także pod kątem funkcji biologicznych z użyciem adnotacji KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), co pozwoliło na zaklasyfikowanie sekwencji do kategorii funkcjonalnych, takich jak metabolizm podstawowy, transport błonowy, detoksykacja czy mechanizmy obronne.
Analiza ilościowa opierała się na względnej liczebności odczytów przypisanych do danego taksonu lub genu oporności, znormalizowanej względem całkowitej liczby odczytów w próbce. Różnorodność mikrobiologiczna została oceniona przy użyciu indeksów bogactwa i różnorodności (np. Shannon, Chao1), natomiast korelacje pomiędzy obecnością ARGs a konkretnymi taksonami oszacowano na podstawie jednoczesnego występowania w tej samej próbce, bez bezpośredniego przypisania na poziomie pojedynczego genomu (ze względu na brak montażu do pełnych metagenomów). Całość analiz przeprowadzono z wykorzystaniem specjalistycznych narzędzi bioinformatycznych w środowisku Linux, w tym pakietów dostępnych w ramach Bioconda, oraz platformy Galaxy.
Zastosowana metodologia pozwoliła na uzyskanie szerokiego obrazu składu mikroflory, potencjalnie patogennych organizmów oraz rozkładu genów oporności w końcowym etapie procesu oczyszczania. W szczególności umożliwiła wykrycie rzadkich, lecz istotnych klinicznie ARGs, oraz oszacowanie potencjalnego ryzyka ich dalszego rozprzestrzeniania w środowisku naturalnym. Choć badanie miało charakter przekrojowy i dotyczyło pojedynczej próbki, przyjęta metodyka pozwala na zastosowanie jej w przyszłości w badaniach porównawczych, monitoringowych oraz w analizach sezonowej zmienności mikrobiomu ściekowego.
Rezultaty badań i ich interpretacja
Analiza metagenomiczna przeprowadzona na próbce ścieków oczyszczonych wykazała, że końcowy produkt procesów oczyszczania komunalnego zawiera bardzo zróżnicowaną i strukturalnie złożoną mikrobiotę, obejmującą zarówno bakterie środowiskowe, jak i potencjalnie patogenne. Na poziomie taksonomicznym, dominującymi typami były Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria oraz Firmicutes – grupy często spotykane w środowisku wodnym, a także charakterystyczne dla mikrobioty związanej ze ściekami. W szczególności, wysoka względna obfitość bakterii z rodzaju Pseudomonas, Acinetobacter i Flavobacterium sugeruje ich wysoką odporność na stres środowiskowy oraz zdolność do przetrwania nawet po wieloetapowym procesie oczyszczania, w tym dezynfekcji UV.
Istotnym odkryciem była także obecność bakterii typowo oportunistycznych, takich jak Mycobacterium, Sphingomonas czy Rhodococcus, które, choć niekoniecznie stanowią zagrożenie w zdrowej populacji, mogą kolonizować nowe środowiska i ulegać adaptacjom ułatwiającym przetrwanie w warunkach ekologicznej presji. Obecność tych taksonów potwierdza, że ścieki oczyszczone nadal stanowią nośnik aktywnej mikroflory, która może wprowadzać do środowiska naturalnego nowe kombinacje genetyczne i funkcjonalne.
Jeszcze istotniejsze z punktu widzenia ryzyka epidemiologicznego było wykrycie szerokiego spektrum genów oporności na antybiotyki (ARGs). Zidentyfikowano aż 119 unikalnych sekwencji odpowiadających za oporność na różne klasy antybiotyków, w tym tetracykliny (np. tetA, tetM), β-laktamy (np. blaOXA, blaTEM), aminoglikozydy (np. aadA, aph(3′)-Ia), makrolidy (np. ermB) oraz chinolony. Wiele z tych genów stanowiło część potencjalnie mobilnych elementów genetycznych (MGE), co wskazuje na ryzyko poziomego transferu międzygatunkowego w warunkach środowiskowych. Wykrycie takich genów jak blaOXA czy blaTEM, które odpowiadają za oporność na antybiotyki o krytycznym znaczeniu klinicznym, jest szczególnie niepokojące w kontekście globalnych wyzwań związanych z antybiotykoopornością.
Analiza funkcjonalna uzyskanych sekwencji, przeprowadzona na podstawie adnotacji KEGG, ujawniła obecność licznych genów związanych z podstawowym metabolizmem komórkowym, a także z systemami transportu błonowego, odpornością na metale ciężkie, mechanizmami detoksykacji oraz reakcjami stresowymi. Wysoka reprezentacja genów kodujących pompy efflux oraz białka opiekuńcze (chaperony) może świadczyć o adaptacyjnym charakterze mikrobiomu ściekowego, umożliwiającym przeżycie w warunkach ekspozycji na toksyczne związki organiczne, antybiotyki oraz środki dezynfekcyjne.
Wyniki wskazują również na istnienie funkcjonalnych powiązań pomiędzy genami oporności a innymi ścieżkami metabolicznymi – np. geny związane z opornością były często współwystępujące z genami kodującymi systemy transpozonowe i integronowe, co może sprzyjać utrwalaniu się oporności nawet w środowisku o niskiej presji selekcyjnej. Jest to zjawisko szczególnie istotne w kontekście zrzutu ścieków do cieków wodnych, gdzie możliwa jest dalsza dyspersja ARGs do mikroflory wodnej, osadów dennych oraz organizmów wodnych.
Ostateczna interpretacja wyników prowadzi do jednoznacznego wniosku, że systemy biologicznego i fizycznego oczyszczania ścieków, choć skuteczne w usuwaniu ładunku organicznego i makroskopowych zanieczyszczeń, są niewystarczające do eliminacji materiału genetycznego o potencjale epidemiologicznym. Obecność licznych i funkcjonalnie aktywnych ARGs, nawet po dezynfekcji UV, wskazuje na konieczność przeformułowania strategii zarządzania ściekami – tak, aby ograniczyć emisję oporności mikrobiologicznej do środowiska. Wyniki sugerują również, że ścieki oczyszczone mogą stanowić nie tylko rezerwuar oporności, ale również jej wektor – co stanowi poważne wyzwanie dla bezpieczeństwa ekologicznego i zdrowia publicznego.
Ograniczenia zakresu badawczego
Pomimo zastosowania zaawansowanych technik analitycznych oraz nowoczesnego podejścia metagenomicznego, niniejsze badanie posiada szereg istotnych ograniczeń, które powinny zostać uwzględnione przy interpretacji i ekstrapolacji uzyskanych wyników. Ograniczenia te mają charakter zarówno metodologiczny, jak i koncepcyjny, co wpływa na zakres możliwych wniosków oraz na potencjalną replikowalność badania w innych kontekstach środowiskowych.
Pierwszym i najistotniejszym ograniczeniem jest próbkowanie ograniczone do jednego punktu czasowego. Analiza została przeprowadzona na pojedynczej próbce pobranej w określonym dniu z odpływu końcowego oczyszczalni ścieków. Taki punktowy charakter badania uniemożliwia ocenę zmienności czasowej profilu mikrobiologicznego i repertuaru ARGs, a tym samym nie pozwala na identyfikację sezonowych fluktuacji ani wpływu zmiennych warunków operacyjnych oczyszczalni (np. zmiany obciążenia hydraulicznego, różnice w składzie ścieków w dni robocze i weekendy, zdarzenia losowe). Badania prowadzone w różnych porach roku i przy różnych warunkach eksploatacyjnych mogłyby ujawnić znacznie większą dynamikę w zakresie obecności i różnorodności mikroorganizmów oraz genów oporności.
Drugim ograniczeniem jest brak możliwości rozróżnienia pomiędzy DNA pochodzącym z komórek żywych a materiałem genetycznym pochodzącym z komórek martwych lub zdegradowanych (tzw. eDNA). Metoda „shotgun metagenomics”, choć wysoce czuła, nie rozróżnia źródeł DNA – oznacza to, że wykryte sekwencje mogą pochodzić od bakterii już nieaktywnych biologicznie lub martwych, co ogranicza możliwość bezpośredniego powiązania obecności ARGs z realnym zagrożeniem zakaźnym lub transferem horyzontalnym. W tym kontekście przydatne byłoby zastosowanie uzupełniających metod, takich jak metatranskryptomika (do oceny ekspresji genów) lub sekwencjonowanie wyłącznie DNA intaktnego (np. po traktowaniu propidium monoazydem), co umożliwiłoby selekcję aktywnych frakcji mikrobiomu.
Kolejnym ograniczeniem badania jest brak montażu danych metagenomicznych do poziomu kompletnych genomów (tzw. metagenome-assembled genomes – MAGs). Analiza oparta była na przypisaniu krótkich odczytów do baz danych referencyjnych, co pozwala na identyfikację genów i taksonów, lecz nie umożliwia jednoznacznego powiązania ARGs z konkretnymi organizmami. W konsekwencji, nie wiadomo, które szczepy bakteryjne realnie niosą zidentyfikowane geny oporności, czy są one zlokalizowane na plazmidach, chromosomie, czy mobilnych elementach genetycznych. Ogranicza to ocenę mobilności genów i ich potencjału do poziomego transferu. MAGs oraz analizy typu linkage-based mogłyby dostarczyć istotnych informacji na temat wektorów oporności i możliwych dróg ich rozprzestrzeniania.
Dodatkowym ograniczeniem, mającym konsekwencje praktyczne, jest brak testów fenotypowych potwierdzających funkcjonalną ekspresję wykrytych genów oporności. Chociaż baza CARD zawiera informacje o genach oporności dobrze opisanych na poziomie molekularnym, sama obecność sekwencji homologicznej nie zawsze oznacza aktywny fenotyp oporności w danym organizmie. Co więcej, geny oporności mogą występować w formach nieaktywnych (np. zmutowanych) lub pozostawać w stanie uśpienia, dopóki nie zostaną aktywowane przez odpowiednie warunki środowiskowe. W związku z tym, zastosowanie testów mikrobiologicznych (np. testów wrażliwości na antybiotyki) lub metodyki RNA-seq pozwoliłoby na bardziej precyzyjną ocenę ryzyka.
Na koniec warto podkreślić, że badanie koncentrowało się wyłącznie na jednym typie środowiska – ściekach komunalnych po oczyszczeniu. Brakuje w nim odniesienia do innych etapów technologicznych (np. osadu czynnego, ścieków surowych, osadów wtórnych), a także do środowiska odbiorczego (np. rzeka, do której odprowadzane są ścieki). Tymczasem pełne zrozumienie losów mikroorganizmów i ARGs w cyklu wodnym wymaga podejścia systemowego, obejmującego analizę wielu matryc środowiskowych i ich wzajemnych interakcji.
Wnioski
Ścieki oczyszczone, nawet po pełnym cyklu technologicznym oczyszczania i dezynfekcji UV, zawierają złożoną i aktywną mikrobiotę, obejmującą zarówno bakterie środowiskowe, jak i oportunistyczne oraz potencjalnie patogenne. Dominacja taksonów z grup Proteobacteria, Bacteroidetes i Actinobacteria wskazuje na ich dużą adaptacyjność do warunków oczyszczalni i środowiska wodnego. Zidentyfikowano łącznie 119 genów oporności na antybiotyki (ARGs), obejmujących wiele klas antybiotyków o znaczeniu klinicznym, w tym β-laktamy, aminoglikozydy, tetracykliny i makrolidy. Oporność ta była kodowana przez geny często związane z mobilnymi elementami genetycznymi, co wskazuje na potencjał ich poziomego transferu. Obecność genów oporności w ściekach oczyszczonych dowodzi, że komunalne oczyszczalnie ścieków pełnią nie tylko funkcję oczyszczania, ale również reaktorów selekcyjnych dla antybiotykooporności, stanowiąc punkt wyjścia dla dyfuzji ARGs do środowiska naturalnego. Analiza funkcjonalna wykazała silne powiązania pomiędzy genami oporności a genami odpowiedzialnymi za detoksykację, transport błonowy i odpowiedź na stres środowiskowy, co może sprzyjać utrwalaniu ARGs w mikrobiomie nawet poza obecnością selekcyjnych czynników, takich jak antybiotyki. Zastosowana metodyka shotgun metagenomics pozwoliła na uzyskanie szerokiego obrazu taksonomicznego i genetycznego próbki, jednak bez montażu do pełnych genomów i bez testów fenotypowych, co ogranicza jednoznaczne przypisanie ARGs do konkretnych szczepów bakteryjnych i ocenę ich ekspresji. Brak danych czasowych oraz analizy porównawczej różnych etapów oczyszczania i środowiska odbiorczego stanowi barierę w pełnym zrozumieniu dynamiki oporności mikrobiologicznej w cyklu wodnym, co wskazuje na konieczność przyszłych badań długoterminowych i systemowych. Uzyskane dane sugerują pilną potrzebę rewizji aktualnych technologii oczyszczania ścieków pod kątem ich skuteczności w eliminacji materiału genetycznego o potencjale epidemiologicznym, w tym wprowadzenia zaawansowanych technologii takich jak filtracja membranowa, procesy utleniania (AOPs) lub sekwestracja DNA. Zarządzanie ryzykiem związanym z obecnością ARGs w ściekach powinno być traktowane jako integralna część strategii przeciwdziałania antybiotykooporności, zarówno na poziomie lokalnym (oczyszczalnie, rolnictwo, zdrowie publiczne), jak i globalnym (monitoring i legislacja środowiskowa).
Artykuł opublikowano w Heliyon.